Cadre général

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Pour que des méthodes alternatives soient utilisées en substitution de tests sur animaux, il faut qu’elles aient été préalablement développées, reconnues par la communauté scientifique, validées.

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En recherche fondamentale et appliquée, les méthodes substitutives sont utilisables librement, sans contrainte de standardisation. Ces méthodes sont scientifiquement reconnues par le processus classique de la validation par les pairs, i.e. la publication dans des revues scientifiques. Ce sont des outils pour la recherche voire même des objets d’étude. Utiliser le terme de « remplacement » est d’ailleurs en partie inapproprié car elles apportent une contribution originale et spécifique à des projets sans chercher à se substituer à des méthodes anciennes utilisant des animaux, qui deviennent éventuellement obsolètes.

Ces méthodes « reconnues » du point de vue scientifique peuvent être utilisées par les industriels en amont d’un processus de validation réglementaire pour du criblage par exemple, évitant des tests animaux et faisant gagner du temps sur le développement, en éliminant des molécules très toxiques ou sans efficacité.

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Mais lorsqu'il s'agit de proposer un nouveau produit sur le marché, il est nécessaire de suivre un certain nombre d'étapes réglementaires, pour notamment garantir la sécurité du produit pour la santé humaine. Dans ce cadre, les alternatives aux tests animaux doivent suivre un parcours de validation afin de les standardiser et les inscrire dans la liste des protocoles autorisés.

Cette reconnaissance internationale est portée par : l’Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE), sous forme de lignes directrices, et/ou le Centre européen pour la validation des méthodes alternatives (ECVAM) au plan européen, pour les substances chimiques ; la Pharmacopée européenne pour les méthodes de contrôle de qualité des médicaments ; la normalisation CEN/ISO pour les milieux et les dispositifs médicaux.

Cette validation confère une garantie de qualité, un caractère opposable et une reconnaissance multilatérale.

Lorsqu'une équipe de recherche souhaite faire valider un test réglementaire alternatif (sans animaux), le processus s'avère contraignant, long et coûteux, sans garantie in fine d'obtenir la validation du test... En effet, pour qu'une méthode alternative puisse être validée dans le cadre réglementaire, elle devra apporter, en plus de ce qui est demandé pour la reconnaissance scientifique (preuve de sa pertinence, de sa capacité à détecter les effets observés  sur l’homme et l’animal), les preuves qu’elle est applicable de façon fiable et reproductible en dehors des laboratoires de recherche.

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Validation et pré-validation réglementaire

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La plateforme PEPPER a été mise en place dans le cadre de la stratégie nationale sur les perturbateurs endocriniens (SNPE), par le Ministère de la transition écologique et le Ministère de la santé ; il a été décidé en 2019 de financer cette plateforme de recherche, associant des partenaires publics et privés. L’objectif est de réaliser une pré-validation des méthodes d’essai en toxicologie et écotoxicologie pour caractériser des propriétés de perturbation endocrinienne. La plateforme doit s’assurer que les méthodes répondent à des critères de qualité et construire des éléments de preuve reconnus internationalement.

Sont intégrés des tests in vitro, in silico, des tests sur des invertébrés ou des poissons-zèbres.

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Trois fonctions sont assurées :

– l’identification et la documentation de méthodes d’essai matures, scientifiquement fondées et répondant à un besoin en termes d’identification des perturbateurs endocriniens ;

– l’organisation de tests sur ces méthodes, en faisant appel à des laboratoires d’essai, pour évaluer la répétabilité et la reproductibilité des résultats ;

– l’accompagnement des acteurs pour transmettre aux instances internationales de validation leurs méthodes et les rapports scientifiques requis.

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Le projet est piloté par l’INERIS, plusieurs industriels, et les départements ministériels impliqués dans la SNPE.

Les financements sont publics (notamment en provenance du programme d’investissements d’avenir ; 5 millions d’euros prévus sur 5 ans) et privés, de la part de secteurs industriels concernés par la production ou la commercialisation de produits.

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Première plateforme de ce genre, PEPPER ambitionne de devenir une structure de dimension européenne contribuant à fiabiliser et accélérer le processus de validation de méthodes élaborées en Europe et encourager leur usage. Les instances de réglementation (OCDE, ECVAM, ECHA, CEN, ISO) sont représentées dans la gouvernance de la plateforme.

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Trois méthodes ont déjà été retenues fin 2020 pour entrer dans le processus de pré-validation (sur 17 éligibles) :

* nPLACENTOX-PE : test in vitro utilisant des lignées cellulaires placentaires. Il mesure la sécrétion d'hormones impliquées dans les pathologies placentaires (par exemple, fausse couche, pré-éclampsie, naissance prématurée). Il dispose d'un historique de données sur au moins 12 substances ;

* méthode d'amélioration de la ligne directrice de l'OCDE TG 456 pour la modélisation dynamique de la voie de la stéroïdogenèse dans les cellules d'adrénocarcinome. Elle mesure les niveaux de stéroïdes produits par les cellules surrénales humaines. La méthode a un débit élevé, une grande précision et utilise une lignée cellulaire disponible dans le commerce ;

* test obésogène du poisson-zèbre (ZOT) : outil d'évaluation des molécules qui ciblent l'adiposité, et donc l'obésité et les dysfonctionnements métaboliques.

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La démarche a fait l'objet d'une publication en 2021 : "Identification of non-validated endocrine disrupting chemical characterization methods by screening of the literature using artificial intelligence and by database exploration".

Pour y accéder : cliquer ici

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Mise au point de méthodes substitutives

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Le projet VALITOX est original car financé par des associations s’opposant à l’expérimentation animale : ProAnima, S.N.D.A, 30 millions d’Amis, Fondation Brigitte Bardot, S.P.A, Ligue Suisse Contre la Vivisection, association Bourdon.

L’objectif est de mettre au point un test de toxicité orale aiguë in vitro, pour le moment toujours essentiellement basé sur une utilisation d’animaux selon les lignes directrices de l’OCDE. Ce test utilise la technique de fluorescence sur des cellules humaines en culture.

​Une publication a concrétisé l'avancée des travaux en 2020 : "Utilisation du système "LUCS" (Light-Up cell system) comme méthode alternative à base de cellules vivantes pour prédire la toxicité orale aiguë chez l'homme". C. Gironde, C. Dufour, C. Furger, Toxicology Reports 2020, 7, 403-412 :

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Résumé : "LUCS (Light-Up Cell System) est un nouveau test sur cellules vivantes qui permet d’évaluer l’homéostasie cellulaire et son altération par un agent toxique. Pour évaluer l'efficacité de LUCS en tant que méthode alternative pour la toxicité orale aiguë, nous avons comparé les CE50 (concentrations efficaces) déterminées dans des cellules HepG2 traitées avec 53 produits chimiques sélectionnés dans la base de données ACuteTox EU avec les CL50 (concentrations létales) correspondantes dans le sang humain dans des cas d'intoxication aiguë humaine. L'analyse de régression linéaire a montré que les résultats de LUCS prédisent les données humaines à 69%. Les DL50 (doses létales moyennes) orales des rongeurs et les EC50 du test LUCS ont ensuite été corrélées aux CL50 humaines en utilisant des bases de données partagées. Les analyses de régression linéaire comparant LUCS et les données animales ont clairement montré que LUCS prédit toujours mieux la toxicité chez l'homme que les données animales.

Ces données de prédictions nous ont incités à simplifier le test LUCS, en l'adaptant aux applications réglementaires, ce qui a abouti à un nouveau protocole avec des profils dose-réponse et des CE50 cohérentes.
Cette étude démontre que la méthode LUCS pourrait être pertinente pour évaluer la toxicité orale aiguë chez l'homme avec un protocole simplifié adapté aux lecteurs de fluorescence disponibles dans le commerce. Nous suggérons que cette nouvelle méthode alternative puisse être utilisée pour les tests de toxicité aiguë systémique en combinaison avec d'autres tests dans le cadre de la réglementation européenne REACH et d'autres réglementations, là où des méthodes alternatives pertinentes font encore défaut."

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Accès à l'article complet : cliquer ici

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Le test a aussi été réalisé sur un modèle de peau élaboré par bio-impression du laboratoire Poietis. Puis doivent suivre d’autres organes : reins, poumons, système nerveux central.

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Les projets européens sont détaillés sur cette page.

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